1）硝酸纖維素膜或尼龍膜上的組織印跡
1．在塑料板上放置兩層Whatman 1號(hào)濾紙，在濾紙上方放上一張普通紙，然后鋪上一層尼龍膜。
2．用雙面刀片從植物組織如大豆的莖上切取一塊切片（厚度約為1mm）。如果組織表面是濕的，則在Kimwipes紙上輕輕吸干或先用蒸餾水洗滌幾秒鐘然后再用Kimwipes紙吸干。用鑷子將組織切片轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，注意一旦將切片放置在膜上就不得再移動(dòng)切片。在切片上放置4層Kimwipes紙，用手指輕壓15～20秒，用鑷子小心拿開紙和組織切片。組織切片經(jīng)甲苯酸藍(lán)染色后觀察其解剖結(jié)果。
3．80℃真空烘烤留有組織印跡的尼龍膜2小時(shí)或用UV cross-linker在紫外光下照射尼龍膜。
4．將留有印跡的膜面向下，放入載玻片上的一滴甲苯酸藍(lán)溶液中，對(duì)組織切片進(jìn)行染色。2～3分鐘后，吸干多余的染料，用間接照明立刻照相。將載玻片翻轉(zhuǎn)，透過玻璃拍攝被染色的組織切片。在切片上粘上幾張紙片以免組織切片接觸顯微鏡。
2）用35S－標(biāo)記的RNA探針檢測植物印跡中的mRNA
1．在Seal-A-MealTM塑料帶中倒入30～40ml洗滌溶液I，65℃清洗留有印跡的尼龍膜4小時(shí)。
2．將膜放入20ml雜交溶液中，68℃預(yù)雜交4小時(shí)。
3．將膜和用35S-標(biāo)記的RNA放入10ml雜交溶液中，68℃雜交20小時(shí)。
4．在 100ml洗滌溶液Ⅱ中42℃清洗尼龍膜20分鐘，換上新鮮洗滌溶液，重復(fù)清洗2次。
5．用100ml洗滌溶液Ⅲ在適當(dāng)?shù)臏囟认拢?0～68℃）。用手提式微型檢測器監(jiān)控尼龍膜上剩余的放射性。清洗完畢后，有義RNA探針雜交的膜不再有放射性信號(hào)，但用反義RNA探針雜交的尼龍膜一般具有可檢測的放射性信號(hào)。該信號(hào)的強(qiáng)度依賴于目的RNA的豐度。室溫下用0.2×SSC對(duì)尼龍膜進(jìn)行簡單清洗，在空氣中晾干。
洗滌緩沖液Ⅲ：
0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)
1 mmol/L EDTA
6．將膜暴露在X-射線膠卷或Kodak T-max 400膠卷下進(jìn)行放射自顯影。用水平力如一小疊書使膜和膠卷保持良好的接觸。一般來說，利用T-max 400膠卷比X-射線膠卷具有更高的分辨率。放射自顯影的時(shí)間依賴于放射性信號(hào)的強(qiáng)弱，通常從4小時(shí)到4天。
7．在X-射線處理器中對(duì)X-射線膠卷顯影。把T-max400膠卷浸入Kodak T-max顯影液I中顯影1分鐘，將底片轉(zhuǎn)移到顯影終止盤中30秒后浸入Kodak快速定影液中5分鐘，然后用蒸餾水洗滌5分鐘。
8．在解剖顯微鏡下觀察組織印跡中mRNA的位置。用Kodak Technical Pan Film 2415膠卷拍攝mRNA的定位模式，然后和用苯甲酸藍(lán)染色的組織切片解剖結(jié)果比較。
elisa試劑盒，進(jìn)口elisa試劑盒，放射免疫試劑盒，amresco，Gibco培養(yǎng)基-南京信帆生物技術(shù)有限公司
在線咨詢