科普：ELISA試劑盒技術(shù)基礎(chǔ)知識
一、酶免疫技術(shù)的分類
酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種。免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的檢測方法，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。它的特點(diǎn)是具有高度的特異性和敏感性。ELISA試劑盒如將抗原或抗體用可以微量檢測的標(biāo)記物（例如放射性核素、熒光素、酶等）進(jìn)行標(biāo)記，則在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測定抗原抗體復(fù)合物本身，而測定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。這種標(biāo)記免疫技術(shù)一般分為兩類，一類用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原或抗體的定位；另一類用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的測定。前者屬于免疫組化技術(shù)范疇，后者則稱為免疫測定。
酶免疫測定根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的與游離的酶標(biāo)記物而分為均相和異相兩種類型，實(shí)際上所有的標(biāo)記免疫測定均可分成這兩類。以標(biāo)記抗體檢測標(biāo)本中的抗原為例，按照簡單的形式是在試劑抗體過量的情況下進(jìn)行，其反應(yīng)式如下：
Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab*
Ab*Ag代表結(jié)合的標(biāo)記物， Ab*為游離的標(biāo)記物。如在抗原反應(yīng)后，先把Ab*Ag與Ab* 分離；然后測定Ab*Ag或Ab*中的標(biāo)記物的量，從而推算出標(biāo)本中的抗原量，這種方法稱為異相法。如在抗原抗體反應(yīng)后Ab*Ag中的標(biāo)記物* 失去其特性，例如酶失去其活力，熒光物質(zhì)不顯熒光，則不需要進(jìn)行Ab*Ag 與Ab*的分離，可以直接測定游離的Ab* 量，從而推算出標(biāo)本中的Ag含量，這種方法稱為均相法。
在異相法中，抗原和抗體如在液體中反應(yīng)，分離游離和結(jié)合的標(biāo)記物的方法有許多種。與放射免疫測定相類似的液相異相酶免疫技測定，在某些激素等定量測定中也有應(yīng)用。但常用的酶免疫測定法為固相酶免疫測定。其特點(diǎn)是將抗原或抗體制成固相制劑，這樣在與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)后，只需經(jīng)過固相的洗滌，就可以達(dá)到抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離，大大簡化了操作步驟。這種被稱為EL1SA 的檢測技術(shù)成為目前臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣的免疫測定方法。
二、方法類型和操作步驟
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：① 固相的抗原或抗體，② 酶標(biāo)記的抗原或抗體，③ 酶作用的底物，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。
（一）雙抗體夾心法：
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，ELISA試劑盒操作步驟如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
（2）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，讓標(biāo)本中的抗原與同相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
（3）加酶標(biāo)抗體：使同相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
（4）加底物：酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。
（二）雙位點(diǎn)一步法：
在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步法不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如果使用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后滯現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
（三）間接法測抗體 ：
間接法是檢測抗體時zui常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗-抗體檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體。故稱為間接法。操作步驟如下：
（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如： 欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人lgG抗體。
（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。
（四）競爭法：
競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與同相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌。
（2）待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與同相抗體的結(jié)合可達(dá)zui充分的量。洗滌。
（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原zui多，故顏色zui深，參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淡，表于標(biāo)本中抗原含量越多。
（五）捕獲法測lgM抗體
血清中針對某些抗原的特異性lgM常和特異性lgG伺時存在，后者會干擾lgM抗體的測定。因此測定lgM抗體多用捕獲法。先將所有血清lgM（包括異性lgM和非特異性lgM）固定在固相上，在除去lgG后再測定特異性lgM。
操作步驟如下：
（1）將抗人lgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人lgM。
（2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的lgM 抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性lgM 結(jié)合。
（4）加入針對特異性的酶標(biāo)抗體，使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。
（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性lgM抗體存在，為陽性反應(yīng)。
（六）親和素和生物素的ELlSA親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4 個生物素分子親密結(jié)合。現(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素一羥基玻璃亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來，就可大大提高檢測的靈敏度。
親和素——生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，ELISA試劑盒可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在同相上先預(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原生物素結(jié)合，通過親和素——生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原固相化，這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素——酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號。
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